红花龙胆(Gentiana rhodantha)为中国西南地区特色药用植物，可全草入药，为2015版《中国药典》新增中药材品种，在治疗湿热黄疸、小便不利、肺热咳嗽等方面具有显著疗效，且已开发了多种与红花龙胆相关的复方配伍剂型。目前关于红花龙胆的研究主要集中于功效应用、化学成分、药理活性、质量评价等方面，分子生物学水平研究甚少。红花龙胆与其他龙胆属植物在民间药用中常相互混用、误用，红花龙胆与龙胆属的进化关系仍存在较大争议。龙胆属药用活性成分龙胆苦苷、獐牙菜苷等环烯醚萜类的生物合成途径也未被完全解析，临床应用和市场价值受到制约。深入探究红花龙胆与龙胆属的系统发育关系，解析龙胆苦苷、獐牙菜苷等重要药用活性成分的生物合成机制，提高红花龙胆的应用价值是目前亟待解决的问题。
本研究收集了贵州地区的红花龙胆资源，利用叶绿体基因组和比较叶绿体基因组学系统梳理红花龙胆及其所在龙胆属的进化关系；基于三代全长转录组、广靶代谢组等多组学技术，筛选红花龙胆中环烯醚萜类成分生物合成关键酶基因；通过体外异源表达系统鉴定关键酶的活性，并结合蛋白建模、分子对接和定点突变等手段，对关键酶的底物选择性进行初步的机制探讨。
主要研究结果如下：
（1）本研究通过测序获得了红花龙胆的叶绿体基因组，联合龙胆属其他已报道的叶绿体基因组进行比较分析、系统发育分析和基于分子钟的分化时间推测，结果显示，红花龙胆与其他传统龙胆属物种的亲缘关系较远，发生了显著的适应性进化事件，并支持了狭蕊组独立为狭蕊龙胆属的观点。基于红花龙胆全长转录组和其他植物基因组，计算物种内旁系同源基因对及物种间直系同源基因对的同义替换率Ks，发现红花龙胆与龙胆科共享一次WGD事件（47.57 Mya）。
（2）基于三代全长转录组、代谢组学联合分析筛选红花龙胆中环烯醚萜类成分生物合成途径中的CYP450、SDR等关键酶。通过大肠异源表达系统，鉴定到5个短链还原酶GrSDRs（GrSDR108E6、GrSDR108E12、GrSDR108E13、GrSDR114C5、GrSDR114C20），能够催化裂环马钱子苷或裂环马钱苷酸的C-8位醛基的还原，生成Secologanol或Demethylsecologanol，随后再通过自发的内酯环化作用转化成獐牙菜苷。5个GrSDRs酶显示出显著的活性差异和底物选择性，仅GrSDR108E6兼具还原裂环马钱子苷和裂环马钱苷酸的活性，其余仅能催化裂环马钱子苷。
（3）GrSDR108E6与来自同一亚家族的GrSDR108E12和GrSDR108E13的氨基酸序列相似度分别为91.3%和52.7%。本研究对双底物活性的GrSDR108E6进行蛋白建模和分子对接，结合一级序列比对预测12-Y、125-V和202-AAG是影响其底物选择性的关键氨基酸位点。随后构建定点突变体并进行催化效率比较，发现GrSDR108E6V125I突变体的催化活性降低了约60%，这可能是其发挥双底物活性的关键氨基酸位点。
综上，本研究从叶绿体基因组及比较基因组学角度获得了红花龙胆与龙胆属系统分类学证据。首次利用多组学技术揭示了红花龙胆中裂环环烯醚萜的生物合成途径“裂环马钱子苷/裂环马钱苷酸—獐牙菜苷”及参与该通路的关键酶GrSDRs，为完整解析獐牙菜苷、龙胆苦苷等重要药用活性成分的生物合成机制提供了理论和实验基础，将促进相关的新药开发和基因工程研究。
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